微滴式數字PCR儀退火溫度設置得太低可能導致非特異性PCR產物的擴增；退火溫度過高可能會降低PCR擴增效率，降低目標產物的產量。

 

　　微滴式數字PCR儀理想的退火溫度跟多個因素有關。要找到理想的Ta溫度，需要嘗試不同的溫度下重復測試相同的反應體系，這需要耗費更多時間和試劑耗材。

 

　　其實與經典PCR反應一樣，使用具有溫度梯度功能的熱循環儀可以很容易地確定微滴式數字PCR反應體系理想的退火溫度，在一次實驗中即可同時測試8個不同退火溫度，以篩選出理想的溫度條件。

 

　　所謂溫度梯度，即在標準的96孔PCR儀中，各行/列在同一個溫度步驟中產生不同的溫度。在一次運行中即可考察不同溫度對PCR擴增效果的影響，極大地減少實驗次數，避免重復實驗產生的不確定因素造成的影響。

 

　　對于某些難度更大的稀有突變檢測實驗中，由于野生型背景的干擾以及引物探針設計困難，很可能出現非特異性擴增。這時ddPCR體系的退火溫度不僅要確保陽性微滴和陰性微滴的區分，還要確保僅發生非特異性的微滴與特異性擴增的微滴明確分開。

 

　　在沒有溫度梯度功能加持的情況下，相同的數字PCR體系優化和構建可能需要經過十數次重復實驗來測試不同退火溫度條件下的實驗效果。此外也需要指出，并非所有的數字PCR技術都能通過溫度梯度的方式優化檢測體系，目前僅兼容標準PCR熱循環儀的數字PCR平臺才能使用溫度梯度熱循環程序。溫度梯度功能是快速優化、構建數字PCR反應體系的利器，能大大減少體系優化階段數字PCR試劑耗材的額外消耗，縮短工作時間，快速取得理想的實驗結果。